شرکت دانش بنیان پویا احراز

راهنمای میکروتوم

استفـاده از ميكـروتـوم روتاری يـك روش سـريـع و سـاده بـراي بريدن نمونه‌هاي بلوکه شـده در پـارافيـن بـه بخـش‌هـاي بـاريك است اما ميكروتوم‌هاي چرخشي، محـدوديـت‌هـايي نيز دارند. يكي از اين محدوديت‌ها مشكل بودن بريدن نمونه‌هاي سخت تر يا نمونه‌هاي با اجزاي سخت تر است. با توجه به طرز كار ميكروتوم روتاری دليل اين موضوع واضح است: با توجه به اين كه مي‌توان تیغ را تنها به صورتي به ميكروتوم وصل كرد كه لبه برنده آن در موقعيتي عمود بر حركت نمونه قرار بگيرد، در صورتی که نيروي زيادي براي برش دادن نمونه‌هاي سخت نياز است كه گاهي منجر به فشرده شدن يا خرد شدن بافت يا اجزاي آن مي‌شود.

زماني كه مي‌خواهيد يك تكه گوشت را ببريد آيا بهتر است كه تیغی را روي آن قرار داده و فقط به سمت پائين فشار دهيد يا اين كه حركت رفت و برگشتي با استفاده از تیغ انجام دهيد به نحوي كه كل طول لبه برنده تیغ استفاده شود. مسلما روش دوم براي برش بهتر است و اين همان روشي است كه در ميكروتوم sledge براي حركت دادن تیغ در برش دادن نمونه‌هاي سخت تر، استفاده مي‌شود.

در تعداد كمي از ميكروتوم‌هاي روتاری امكان اتصال يك نگهدارنده قابل تنظيم تیغ وجود دارد كه با اين نگهدارنده مي‌توان تیغ را زاويه دار كرد به نحوي كه بخش بزرگي از لبه آن براي توليد ضربه رفت و برگشتي براي برش دادن نمونه استفاده شود (اين زاويه را زاويه انحراف يا declination مي‌گويند.) با اين كه اين ميكروتوم‌هاي روتاری اصلاح شده نمي توانند جايگزين يك ميكروتوم sledge شوند، اما براي نمونه‌هايي كه براي خوب برش داده شدن به وسيله ميكروتوم‌هاي روتاری، فقط كمي سخت هستند مي‌توانند بسيـار مفيـد و كـارا باشند. همچنين اين ميكروتوم‌ها براي برش دادن celloidin بسيار مفيدند.

اگـر بـافـت‌هـاي بـا اجـزاي سخـت احاطه شده با اجزاي نرم، توسط يك ميكروتوم روتاری برش داده شوند، احتمال دارد كه اجزاي سخت آن پخش شوند یعنی اجـزاي بـافـت در طـول section كشيده مي‌شوند. در مورد برخي از بافت‌ها اين يك مشكل معمول است. اين مشكلات را مي‌توان با بلوکه كردن نمونه در يك ماده سخت تر از سخت ترين جزء آن، تا حدي حل كرد اما گفتن اين كار، ساده تر از انـجــام دادن آن اسـت! كـلا هـر چـه دمـاي ذوب پارافين مورد استفاده بالاتر باشد، پارافين سخت تر است. پارافين هائي كه نقاط ذوب بالاتر (بيش از 70 درجه سانتيگراد) دارند، نيز در بازار موجود هستند؛ اما تهيه آن‌ها توسط افراد مشكل است. روش‌هاي جاسازي ديگري غير از پارافين هم هسـت كه بتوانند به ماتريس‌هاي سخت منجر شوند اما هر روشي مشكلات خودش را دارد و بـرخـي از ايـن روش‌هـا، نياز به استفاده از انواع ديگري از ميكروتوم‌ها و تیغها دارند.

برش دادن نوارهاي طولاني با استفاده از يك ميكروتوم sledge مشكل است.: با حركت تیغ كه آخرين نوار برش به آن چسبيده است، (نوار كه متشكل از برش هائي كه بسيار به هم متصل شده اند)، خيلي راحت پيوستگي خود را از دسـت مـي‌دهـد يـك راه حـل، چسباندن كاغذي روي تیغ است كه به عنوان نگهدارنده نوار برش ها عمل خواهد كرد. اما با ايــن حــال بــريـدن نـوارهـاي بـا طـول بـيـش از 10 سانتيمتر مشكل خواهد بود. اما يك ميكروتوم روتاری مي‌تواند به راحتي نوارهاي با طول 20 يا 30 سانتيمتر را برش دهد.

بزرگترين مزيت ميكروتوم sledge مي‌تواند بــزرگـتــريــن اشـكــال آن هــم بــاشــد: از انـجــا كــه پارامترهاي زيادي بايد روي اين نوع ميكروتوم تنظيم شوند احتمال زيادي وجود دارد كه يكي از اين تنظيمات اشتباه باشد و لذا برش‌هاي غيرقابل استفـاده اي توليد شوند. مهم‌ترين پارامترها در هنگام برش دادن يك نمونه يا ميكروتوم Sledge عبارتند از: زاويه ي برش تیغ، زاويه انحراف تیغ و سرعت برش كه اين پارامترها نه تنها با تغييرات مشخصه‌هاي بافت تغيير مي‌كنند بلكه به دما و رطوبت و ... محيطي كه برش در آن انجام مي‌شود هم وابسته اند.

برش دادن نمونه‌هاي سخت تر مشكل است. يــك روش خــوب ايـن اسـت كـه سعـي شـود از قسمت ابتدائي بلوك نمونه (جائي كه هنوز بافت ندارد)، برش‌هاي تا حد امكان خوب تهيه شود و از ايـن تنظيمات به عنوان نقطه شروع در برش بافت استفاده شود

برش دادن

قبل از اين كه برش دادن با ميكروتومي انجام شود، معمولا مواد بيولوژيك در يك ثابت كننده سخت تر قرار داده مي‌شوند. اين فرايند بلوکه كـردن يا embedding ناميده مي‌شود. اين كار با اسـتـفــاده از جـريـان دادن يـك مـاده مـايـع، مـانـنـد پارافين يا اپوكسي، حول نمونه كه در يك قالب قرار داده شده است، انجام مي‌شود. اين تركيب بعدا سخت شده و تشكيل يك بلوك مي‌دهد كه به راحتي بريده مي‌شود.

Declination يا انحراف، زاويه تماس بين تيغ و ضلع قائم نمونه است. اگر تيغه چاقو در زوايه ي درستي قرار گرفته باشد (يعني انحراف برابر با نود درجه باشد)، برش مستقيما با استفاده از يك مود بر اساس فشار انجام مي‌شود و بنابراين نيروها بزرگتر هستند. اگر تیغ كج باشد، حركت نسبي تیغ به صورت افزاينده اي موازي با حركت نمونه است كه امكان انجام برش دادن را فراهم مي‌كند. اين رفتار براي نمونه‌هاي بزرگ يا سخت بسيار مهم است.

شيب تیغ، زاويه بين سطح تیغ با نمونه است. براي رسيدن به يك نتيجه بهينه اين زاويـه بايد مناسب انتخاب شود. زاويه بهينه وابسته به هندسه تیغ، سرعت برش و پارامترهاي ديگر است. اگر مقدار زاويه به صفر تنظيم شود، برش تیغ اغلب نامنظم مي‌شود و بايد محل جديدي از تیغ براي صاف كردن اين استفاده شود.

اگر اين زاويه خيلي بزرگ باشد نمونه ممكن است مچاله شود. با افزايش بيشتر زاويه ممكن است به خود تيغ آسيب وارد شود.

‌اصول عملكرد كلي ميكروتوم

اجزاي اصلي يك ميكروتوم روتاری عبارتند از شاسی دستگاه، روپوش یا بدنه دستگاه، گيره یا کلمپ نمونه، محور نمونه، دسته گردان میکروتوم ، پایه و هولدر تیغ، سیستم فیدینگ نمونه. انواع مختلفي از گيره‌ها براي نگهداشتن بلوك نمونه مي‌توانند داخل استوانه نمونه فيت شود.

ياتاقان‌هاي غلتكي، حركت هموار و يكنواخت چرخ را تضمين مي‌كنند. گاهي دسته‌هاي گردان ميكروتوم، كنترل ترمز يا قفل چرخ هم دارند تا ايمني اپراتور در هنگام قرار دادن بلوك نمونه در گيره برقرار شود.

كل بازه حركت فیدینگ تقريبا 25 ميلي متر است و نبايد از اين بازه بيشتر شود. در برخي از ميكروتوم‌هاي روتاری، به صورت اتوماتيك مكانيزم جلوبردن زماني كه به حد بالاي موقعيت رو به جلو مي‌رسد، خلاص مي‌شود.

برخي از ميكروتوم‌هاي روتاری يك مكانيزم feed پس كشنده دارند كه در پائين حركت عمودي بلوك به داخل تیغ، بلوك نمونه را از لبه تیغ دور مي‌كند و در طول حركت برگشتي به سمت بالا آن را پس نگه مي‌دارد. بدون پس نگه داشتن، ممكن است نمونه در طول حركت به سمت بالا از تیغ را خراش داده و تيغه آن را كند كند. به ويژه در برش پلاستيك كه در آن بلوك‌هاي نمونه سخت تر هستند و مي‌توانند آسيب بيشتري به تیغ برسانند، پس كشيدن نمونه، مفيدتر است. برخي از سازندگان سیستم فیدینگ كه اين قابليت را ندارند، ادعا مي‌كنند كه تماس بين تیغ و نمونه را مي‌توان با اسـتـفـاده از تیغ هـاي بـا كـيـفـيـت خـوب و تـيز نگهداشتن لبه‌هاي تیغ با استفاده از تكنيك‌هاي مناسب تيز كردن، حداقل كرد. بقيه بر اين اعتقادند كه درجه scraping همان قدر كه وابسته به دقت ميكروتوم است وابسته به كيفيت و تيزي تیغ نيز هست.

سيستم نگهدارنده تیغ قابل تنظيم است و براي تطبيق با انواع مختلفي از تیغ ها و قفل كردن تیغ در محل خود براي برش دادن طراحي مي‌شود يك محافظ built-in، زاويه برش تیغ را كنترل مي‌كند. معمولا فقط بخش كوچكي از تیغ در هنگام برش استفاده مي‌شود. بخش‌هاي ديگر تیغ را مي‌توان براي ايمني كاربر، با يك محافظ پوشاند.

مواد متفاوت مورد استفاده براي جاسازي كردن  بلوکه مردن بافت، مشخصات متفاوتي دارند و نياز به تیغ هاي متفاوت و نيز تنظيمات ضخامت متفاوت دارند. مزيت اصلي مـيـكـروتـومـي پـارافـيـن، سـادگـي ايـجـاد نـواري از برش هـاي سـري و سـرعـت ايجاد برشهـ اسـت. الـبـتـه برشهاي پارافين رزولوشن برش هاي بلوکه شده در پلاستيك با ضخامت كمتر را ندارند. همچنين احتمال اين كه نمونه‌ها جمع و چروكيده شوند، در آن‌ها بيشتر است.

نقاط ضعف ميكروتومي پلاستيك اين است كه برش ها يك نوار سريال تشكيل نمي دهند و تیغ هاي استيل به خاطر سخت بودن بلوك‌ها بيشتر در معرض آسيب هستند. اپراتور مي‌تواند براي حل اين مشكل از يك تیغ هاي tungsten-carbide-tipped يا تیغ شيشه اي استفاده كند.

تكنيك‌هاي بريدن نيز با تغيير ماده بلوکه کردن تغيير مي‌كنند. بلوك‌هاي پارافين بايد با يك ضربه كند و به دنبال آن يك ضربه برگشتي سريع برش داده شوند؛ بافت‌هاي سخت را بهتر است با يك ضربه سريع و محكم برش داد. بلوك‌هاي پلاستيكي بهتر است با يك ضربه سريع و سپس يك وقفه براي اينكه برش، فرصت بازشدن و صاف شدن قبل از ضربه بعدي را داشته باشد، بريده شوند.

تیغ هاي استيل با اين كه براي برش دادن بافت‌ها براي ميكروسكوپ نوري مناسبند، امـا نـمـي تـوان از آن‌هـا در اولـتـرامـيـكـروتـوم بـراي گرفتن برش هائي براي بررسي با ميكروسكوپ الكتروني استفاده كرد. تیغ استيل به خاطر ضخامت لبه و كندشدن سريع آن، مي‌تواند در هنگام بريدن بافت به آن آسيب بزند. از آنجا كه براي ميكروسكوپ الـكـتـروني نياز به جزئيات زيادي از برش است در اولتراميكروتوم‌ها از تیغ هاي شـيـشـه‌اي، الـمـاس يـا sapphire كـه لـبـه‌هـاي بـرش بـسـيـار بـاريـك دارنـد و براي مدت طولاني‌تري تيزي خود را حفظ مي‌كنند، استفاده مي‌شود.

تیغ هاي ميكروتوم

طــراحــي يـك تیغ ميكـروتـوم وابستـه بـه جــنــس و روش آمــاده ســازي نـمــونــه‌هــا و نـيــز نيازمندي‌هاي نهائي نمونه (به عنوان مثال كيفيت و ضخامت برش ها) است.

طراحي تیغ و انواع برش ها

عـمـوما تیغ ها با شكل تيغه تیغ مشخص مـــي‌شـــونـــد كـــه در ســـه دســتــه قــرار مــي‌گـيــرد: طـراحـي‌هـاي بـا شـكـل قـلـمي ، با شكل گـــوه‌اي و مــقــعـــر مــسـطــح تیغ هـاي ميكروتوم مقعر مـسـطـح، بـسـيـار تـيـز هـسـتـنـد اما از طرفي بسيار ظريف اند و بنابراين فقط با نمونه‌هاي بسيار نرم اسـتـفـاده مـي‌شوند. تیغ هاي با شكل گوه اي، نسبتا پايدارترند و در برش مواد با سختي متوسط مانند برش نمونه‌هاي برودتي يا اپوكسي استفاده مي‌شوند. نهايتا شكل قلمي با لبه پهن خود باعث افزايش پايداري مي‌شود و در عين حال نياز به نيروي بسيار بيشتري براي برش نيز دارد.

بـراي اولـتـرامـيـكـروتـوم ها، نياز به تیغ هاي شيشه اي و الماس است. لذا پهناي برش تيغ در حد چند ميلي متر است و بنابراين به ميزان قابل تـوجـهـي نـسـبت به تیغ هاي سنتي ميكروتوم، كـمـتـر اسـت. تیغ هاي شيشه اي ممكن است براي آماده سازي‌هاي اوليه نمونه استفاده شوند؛ در حالي كه تیغ هاي الماس براي برش دادن نـهـائـي اسـتـفـاده مـي‌شوند. تیغ هاي شيشه اي مــعــمـــولا ظــروف كــوچـكــي دارنــد كــه بــا نــوار پلاستيكي ساخته شده است و با آب پر مي‌شوند تا امكان شناورشدن نمونه براي اين كه بعدا جمع آوري شود، فراهم گردد. تیغ ‌هاي الماس ممكن است داخل چنين ظرفي كه از قبل موجود است ساخته شوند تا به شيوه مشابه بتوان نمونه‌ها را جمع آوري كرد.

تيز كردن تیغ میکروتوم

تيزكننده‌هاي اتوماتيك تیغ ميكروتوم، به صـــورت مــكـــانــيــكـــي زاويــه بــرش تیغ هــاي مورداستفاده براي برش دادن بافت را به حالت اول برمي گردانند. تیغ تيز مانع از آسيب‌هايي مـانـند دندانه دندانه كردن و شكاف دادن بافت مـي‌شـود. قـبـل از تـولـيد تيزكننده‌هاي مكانيكي تیغ ميكروتوم، تيزكردن تیغ يك مهارت اساسي براي تکنسین  حرفه اي بود. Honning يعني تيز كردن براي ايجاد شيب و stropping يعني پرداخت كردن براي ايجاد لبه ي برنده با دست انجام مي‌شدند و زمان و تلاش زيادي براي انجام اين كارها صرف مي‌شد. تيزكننده‌هاي اتوماتيك تیغ ميكروتوم اين اعمال را سريع تر انجام مي‌دهند و لبـه‌هاي برنده با كيفيت بالاتري نسبت به روش‌هاي دستي ايچاد مي‌كنند. همچنين استفاده از تيزكننده‌هاي اتوماتيك اين امكان را به تکنسین مي‌دهد كه زمان و توجه خود را صرف آماده سازي و برش بافت كند.

تيزكردن اتوماتيك تیغ شامل دو مرحله مي‌شود: مرحله اول، پرداخت كردن تيغ با استفاده از يك سطح ساينده است. سمباده زدن تیغ ، دندانه‌هاي روي لبه برش را از بين مي‌برد و شيب روي تيغ را شكل مي‌دهد. سپس لبه با استفاده از يك سمباده بسيار ظريف، صيقل داده مي‌شود. صيقل دادن، بي نظمي‌هاي خيلي جزئي ناشي از پرداخت را هم از بين مي‌برد و تراش يا شيب ثانويه اي را ايجاد مي‌كند كه لبه اصلي برش است. صيقل دادن به تنهائي مي‌تواند تيغ هائي را كه كمي كند شده اند نيز دوباره تيز كند. بعد از فرايند تيز كردن، چاقو بايد شسته شود تا تمام باقيمانده‌هاي سمباده يا فلز از بين بروند و بعد هم با ميكروسكوپ بررسي شود تا اطمينان حاصل شود كه تمام دندانه‌ها و بريدگي‌ها از بين رفته اند. يك روش اتوماتيك تيزكردن از فرايند رفت و برگشتي استفاده مي‌كند؛ به اين صورت كه، تیغ ميكروتوم به يك بازوي مكانيكي، متصل مي‌شود. بازو، تیغ را پائين مي‌آورد تا به يك صفحه ثابت مسي يا شيشه اي پوشانده شده با يك ماده ي ساينده برسد و سپس تیغ را به جلو و عقب حركت مي‌دهد. بعد از اين كه تیغ به تعداد تكرار از پيش تعيين شده اي روي صفحه، جلو و عقب برده شد، بازو تیغ را چرخانده و فرايند جلو و عقب بردن دوباره تكرار مي‌شود (برخي از تيزكننده‌ها سطوح شيشه اي لرزشي دارند كه فرايند را تسهيل مي‌كند.) تكراركردن اين سيكل با استفاده از مواد ساينده با درجات زبري مختلف، اين امكان را فراهم مي‌كند كه بتوان از يك دستگاه هم براي پرداخت كردن و هم براي صيقل دادن استفاده كرد.

يك تيزكننده از مكانيزم كشوئي استفاده مي‌كند به اين صورت كه تیغ را در طول جفت چرخ‌هاي پرداخت و صيقل، به جلو و عقب مي‌كشد و سطح تیغ را هم متناوبا جابجا مي‌كند به نحوي كه به ترتيب هر دو سطح تیغ تيز شوند. يك جفت چرخ آغشته به اكسيد آلومينيوم، لبه را پرداخت كرده و يك جفت چرخ با استفاده از يك خمير پوليش ساينده، آن را صيقل مي‌دهد.

روش ديگر از يك بازو براي نگه داشتن تيغ در كنار يك صفحه افقي در حال چرخش كـه تـركيـب سـاينده دارد، استفاده مي‌كند. با چرخش ديسك، ماده ساينده بين تيغه و ديسـك، لبه برنده تیغ را پوليش مي‌كند. تركيبات ساينده مختلف با درجات زبري متفاوت مي‌توانند براي پوليش تیغ ميكروتوم استفاده شوند.

تمام اين روش‌ها مي‌توانند براي تيز كردن يك تيغ ميكروتوم نوع C كه دو سمت آن مشـابـه اسـت، استفـاده شـوند. تيغ ‌هاي استاندارد نوع C مي‌توانند اجسام منجمد يا نمونه‌هاي جاسازي شده در اغلب قالب‌هاي سخت (مانند پارافين) را برش دهنـد. بسيـاري از انـواع غيـراستـانـدارد تيغ شامل تيغ ‌هاي A، B و D لبه‌هاي برش غيرمتقارن دارند كه براي بريدن انواع مواد ديگر طراحي شده اند؛ اين تيغ ‌ها بايد فقط با دستگاه‌هايي تيز شوند كه با توجه به طراحيشان بتوانند تیغ هاي با لبه‌هاي غيرمتقارن را بپذيرند. به عنوان مثال تیغ نوع D سطح اريب بسيار كم در يك سمت و يك سطح اريب وسيع تر در سمت ديگر براي برش مواد سخت دارد.

اغلب تيزكننده‌ها به اپراتور امكان مي‌دهند زاويه تیغ را بعد از تماس تيغ با سطح تيزكننده تنظيم كنند. بسياري از دستگاه‌ها همچنين كنترل‌هاي اتوماتيك براي تنظيم در حين تيزكردن تیغ دارند. يك دستگاه، ميكروپروسسوري دارد كه به كاربران امكان بـرنـامـه ريـزي پـروتكل‌هاي تيزكردن مانند نرخ چرخاندن تیغ و تنظيم ميزان اريب بودن (تنظيم زاويه تیغ) را مي‌دهند.

پاك كردن بلوك پارافين

مـعـمـولا در ابتـداي كـار يـك بلـوك پـارافينـي حاوي نمونه داريم به صورتي كه اطراف نمونه مـقـدار زيـادي پـارافـيـن وجود دارد. اين پارافين اضافي بايد از بين برده شود و بلوك پارافيني بايد قبل از برش داده شدن، پاكسازي شود.

وقتي در يك بلوك پارافيني چند نمونه با هم جاسازي مي‌شوند و تنها برش هاي از آن‌ها مورد نياز است، در اين حالت هم بايد پاكسازي بلوك انجام شود. در اين حالت لازم است كه ابتدا آن‌ها را از هم جدا كرد و سـپـس مـي‌تـوان هـر كـدام را جداگانه پاكسازي كـرد. ايـنـكـه ضـخـامت نهائي لايه پارافين حول نمونه چقدر باشد، توسط تکنیسین تعيين مي‌شود. به عنوان يك قانون كلي مي‌توان گفت كـه بـهـتـر اسـت لايـه پـارافـيـنـي دور نمونه خيلي ضخيم نباشد: هرچه سطح بلوك پارافيني كه قرار اســت بــرش داده شــود بــزرگـتـر بـاشـد، ريـسـك مشكـلات بـرش نيـز بـالاتـر مـي‌رود. البتـه برش دادن پـارافيـن خـالـي (بـدون بـافت) هيچ ارزشي ندارد و فقط باعث كند شدن سريع تر تيغه چاقو مي‌شود. لذا از نظر اقتصادي بهتر است كه تیغ براي بريدن آنچه واقعا ارزش دارد به كار برده شود. اگر تنها يك نمونه در يك بلوك جاسازي شده باشد، پاكسازي ساده است: آنقدر از اطراف پارافين برش داده مي‌شود تا تنها لايه نازكي از پارافين دور نمونه باقي بماند. البته برش‌ها نبايد به صورت لايه‌هاي ضخيم انجام شوند، چرا كه ممكن است باعث ايجاد ترك در بلوك شود.

در پـاكسازي بايد محورهاي نمونه را در نظر گرفت: سمت جلوئي بلوك بايد در صورت امكان موازي با سطح برش باشد. اگر برش هاي عرضي قرار است گرفته شوند، نمونه بايد دقيقا در وسط بلوك پارافيني باشد. اگر نمي توان اين كار را كرد، مي‌توان با چرخاندن بلوك پارافيني روي ميكروتوم تا حدي اين مشكل را حل كرد؛ اما اين را بايد به عنوان راه حل دوم مدنظر داشت. سطوح بالا و پائين بلوك پاكسازي شده بايد موازي هم باشند وگرنه نوارهاي برش توليدي، منحني خواهند شد و اين مـوضوع مخصوصا اگر بخواهيد اسلايدهايي بسازيد كه حاوي چند برش سريالی باشد، مشكل ساز خواهد شد. زماني كه نمونه به سختي قابل مشاهده است، مي‌توان يك سمت بلوك را به صورت زاويه دار برش داد. در اين صورت با اين كه نمونه‌ها به سختي ديـده مـي‌شـونـد ولي مي‌توان برش هاي مجزا روي نوار را به راحتي تشخيص داد

قسمت پشتي بلوك (يعني سمتي كه رو به تیشو تک قرار مي‌گيرد) هم بايد پاكسازي شود: از آنجا كه پارافين كمابيش الاستيك است، لازم است اين عمل تا جائي انجام شود كه تنها يك لايه نسبتا نازك از پارافين بين سمت پشتي بلوك و تیشو تک باقي بماند. اگر اين لايه خيلي ضخيم باشد، مي‌تواند منجر به ايجاد برش هائي شود كه ضخامت غيريكسان دارند.

اگر نمونه اي كه قرار است برش داده شود سخت باشد مي‌توانيد بلوك را به صورت هرمي پاكسازي كنيد به نحوي كه سطح پايه آن بزرگتر باشد. با اين روش بلوك مي‌تواند نيروهاي بزرگ‌تر را بدون جداشدن از تیشو تک را تحمل كند.

پـارافين‌هاي حاصل از پاكسازي بلوك ها، مي‌توانند مجددا براي بلوکه كردن نمونه‌هاي ديگر استفاده شوند. در صورت نياز مي‌توان پارافين را با استفاده از فيلترهاي كاغذي درشت در انكوباتور فيلتر كرد.

قراردادن بلوك و تنظيم ميكروتوم

ميكـروتـوم بـايـد اين امكان را داشته باشد كه بتوان حركت عمودي نگهدارنده نمونه را قفل كرد. بايد از اين قابليت در هنگام قرار دادن نمونه روي ميكروتوم استفاده كرد. توصيه مي‌شود كه هنگام قرار دادن نمونه روي ميكروتوم و تنظيم جـهــت آن، تیغ مـيكـروتـوم در محـل خـود نباشد. به منظور تنظيم جهت، مي‌توان از يك نوار آلـومينيومي يا يك نگهدارنده خالي تيغ كه در نـگـهـدارنـده تیغ مـيـكـروتـوم قرار داده شده است استفاده كرد. بعد از انجام تمام تنظميات و درست قبل از شروع عمل برش، تیغ در محل خود قرار داده مي‌شود.

هـمانطور كه گفته شد، سمت جلوئي بلوك بايد در صورت امكان موازي با سطحي كه قرار است برش داده شود باشد. يعني وقتي از كنار نگاه مي‌كنيم، سطحي كه قرار است برش داده شود بايد موازي با حركت عمودي گيره نمونه، جهت دهـي شـده بـاشـد و وقـتـي از بـالا نـگـاه مـي‌كـنيم سطحي كه قرار است برش داده شود بايد موازي با لبه برش چاقو باشد.

براي برش هاي عرضي، محور طولي نمونه بايد زاويه 90 درجه با حركت نگهدارنده نمونه در طول برش دادن داشته باشد. براي برشهاي طولي محور طولي نمونه بايد موازي با لبه برش تیغ باشد.

بـعد از اين كه بلوك نمونه به درستي جهت دهـي شـد و روي مـيـكـروتـوم قـرار گـرفـت بـايد تیغ ميكروتوم را در جاي خود قرار داد. اين تیغ ها بسيار تيز هستند و مي‌توانند برش‌هاي سختي در دست ايجاد كنند و لذا بايد در كار با آن‌هـا بـسـيـار احـتـياط كرد. اگر از تیغ درست نگهداري شود، تيزي خود را به مدت طولاني حـفـظ مـي‌كـنـد. بـعـد از كـنـد شدن، تیغ بايد با تيزكننده مناسب، تيز شود. بعد از قرار دادن تیغ در مـحـل خـود، بـا اسـتفاده از پيچ‌هاي مربوطه، موقعيت آن محكم مي‌شود. معمولا چهار پيچ وجود دارند كه دو تا براي محكم كردن تیغ و دو تا براي محكم كردن نگهدارنده‌هاي قابل حركت و تیغ در زاويه انتخاب شده هستند.

تیغ بايد با زاويه اي مناسب نسبت به نمونه قرار داده شود. زاويه اي كه بين سطح برش تیغ و حركت عمودي ميكروتوم ايجاد مي‌شود بسيار مهم است. اگر اين زاويه باز باشد، تیغ نمونه را برش نمي دهد بلكه فقط قطعه اي از بلوك را مي‌برد. از طرف ديگر اگر اين زاويه خيلي تند باشد برش را نمي گیرد يا فقط يك برش بسيار كوچك ايجاد مي‌كند. مقدار بهينه اين زاويه بين 5 تا 10 درجه است. بعد از تنظيم زاويه درست، بايد هر چهار پيچ را محكم كرد.

حال بايد تیغ و نمونه را به‌هم نزديك‌تر نمود. وقتي بلوك پارافيني حدود نيم ميليمتر يا يك چهارم ميلي متر با لبه ي تیغ فاصله دارد بايد تمام پيچ‌هاي ميكروتوم مربوط به نگهدارنده تیغ و گيره نمونه، به دقت بررسي شده و محكم شوند. سپس ضخامت برش را حدود 8 تا 10 ميكرومتر تنظيم كرد و اگر برش به خوبي انجام شود مي‌توان آن را تا مقدار مطلوب كم كرد. بعد از محكم كردن تمام پيچ‌ها مي‌توان شروع به چرخاندن دسته با سرعت متوسط كرد.

 

مسائل گزارش شده

اگر تیغ در موقعيت ايمني قرار داده نشده باشد يا براي بريدن يك بلوك سخت، به اندازه كافي تيز نباشد، احتمال لرزش زياد يا ضربه زدن وجود دارد كه مي‌تواند به صورت متناوب منجر به توليد برش هاي با ضخامت كم و زياد شود. برش هاي برش داده شده با تیغ كند، به لبه تیغ مي‌چسبد و به جاي جداشدن از بلوك، روي هم جمع مـي‌شـونـد. برش هـائـي كـه تـاشـده، چين خورده اند يا فشرده شده اند براي تحليل ميكروسكوپي مناسب نيستند. هر دندانه يا بريدگي روي لبه چاقو نيز مي‌تواند برشها را در هنگام برش، خراش دهد.

با اين حال حتي تیغ هاي تيز نيز مي‌توانند برش هاي نمونه چين خورده ايجاد كنند. وسايلي مانند صفحات antiroll نيز مي‌توانند به نگهدارنده تیغ متصل شوند تا تغييرشكل نمونه حداقل شود.

آب نمونه بايد گرفته شود، نمونه بايد خالص شود و متناسب با نوع بافتي كه بريده مي‌شود، جاسازي شود. همانطور كه ذكر شد ضربه برش و ضخامت برش نيز با تغيير محيـط جاسازي و نوع بافت تحت بررسي، تغيير مي‌كنند. اگر اين تنظيمات درست نباشند، ممكن است نمونه دچار شكستگي يا اعوجاج شود.

الكتريسيته ي ساكن روي تیغ مي‌تواند كار با برش ها را دشوار كند. اين مشكل را مي‌توان با اتصال ارت ميكروتوم به لوله آب و نيز افزايش همزمان رطوبت در آزمايشگاه تا حدي حل كرد.

اگر ميكروتوم‌هاي روتاری درست نگهداري نشوند، برشهاي با كيفيت پايين توليد مي‌كنند. روغنكاري مرتب و تميزكردن اجزا طبق دفترچه راهنماي دستگاه و تيز كردن و بازرسي روتين چاقو براي كارائي موثر دستگاه لازم است.

ذرات پـارافيـن كـه در حيـن بـريدن بافت‌هاي جاسازي شده در پارافين يا در حين تميزكردن ميكروتوم، روي سطح كف مي‌افتند، ممكن است با هم جمع شده و باعث سرخوردن كارمندان و افتادن آن‌ها شوند. مي‌توان با قرار دادن ميكروتوم در يك محفظه پلكسي گلاس از پخش شدن اضافات پارافين جلوگيري كرد يا اينكه سطح را به صورت روزانه با استفاده از يك حلال صنعتي پارافين (يا ديگر هيدروكربن‌هاي ) پاك كرد. با اين وجود اكثر آزمايشگاه‌ها از كف پوش‌هاي راه راه استفاده مي‌كنند.

يــك نـكـتــه مـهــم مــربــوط بــه ايـمـنـي، ريسـك جراحت در هنگام كار و تميزكردن ميكروتوم است. كاربران ميكروتوم بايد احتياطات كلي (به عــنــــوان مــثــــال پــــوشــيـــدن دســتــكـــش و لــبـــاس آزمايشگاهي) را رعايت كنند و احتياطات خاص در هنگام كار با نمونه‌هاي بافت، تنظيم تیغ مـيـكــروتــوم و نـگـهــدارنــده نـمــونــه، تـمـيـزكـردن مـيكروتوم بعد از استفاده و پياده كردن دستگاه براي نگهداري يا تعمير را نيز در نظر داشته باشند.

اسـتـفـاده مـكـرر از مـيـكـروتوم‌هاي روتاری دستي ممكن است احتمال ابتلا به اختلالات حركتي را زياد كند. توليدكنندگان در حال طراحي ميكروتوم‌هاي روتاری با مشخصات ارگونوميك تر  كه در آن‌ها بخشي از كارها توسط موتور انجام مي‌شود هستند.

يـك نكتـه ايمنـي در هنگـام استفـاده از تيـزكننـده‌هـاي تیغ ميكـروتوم مربوط به كاركردن اتفاقي تيزكننده در زماني است كه پوشش دستگاه باز است. برخي از دستگاه‌ها قفل‌هاي ايمني دارند كه از اين موضوع جلوگيري مي‌كند. اين مشخصه ايمني هم بايد براي اطمينان از عملكرد درست، به صورت پريوديك بازرسي شود.

تيزكننده بايد به صورت منظم روغنكاري و طبق توصيه سازنده تميز شود. پرداخت كننده‌ها و صيقل دهنده‌ها هم بايد به صورت منظم بازرسي شوند و سالم بودن آن‌ها بررسي شود تا از آسيب رسيدن به تيغ جلوگيري شود.

ملاحظات خريد توصيه‌هاي ECRI

براي اطمينان از ايمني و كارائي موثر يك ميكروتوم رئتاری، بايد يك سري فاكتورها را در نظر گرفت. محافظ‌هاي تیغ و قفل دسته چرخان براي پيشگيري از آسيب تصادفي ناشي از تیغ ميكـروتـوم ضـروري اند. اغلب نمونه‌هاي معمول در پارافين يا پلاستيك جاسازي مي‌شوند؛ بنابراين ميكروتوم بايد بتواند حداقل با اين مواد كار كند. در مورد كاربردهاي خاص ممكن است نياز باشد كه ميكروتوم بتواند با مواد جاسازي ديگري نيز كــار كـنــد. مـمـكــن اســت اپــراتــورهــا تــرجيـح دهنـد بـه منظـور تسهيـل كـار بـا نمـونـه از مـيـكـروتـوم‌هـاي motorized اسـتـفـاده كنند. به ويژه در محيط‌هاي با خروجي زياد كه ميكروتوم به صورت پيوسته استفاده مي‌شود، اين نكته بسيار مفيد است.

ملاحظات ديگر

انتخاب و استفاده مناسب ميكروتوم براي توليد برشهاي خوب از بافت براي تحليل ميكروسكوپي ضروري است. آزمايشگاه‌هاي هيستوپاتولوژي بيمارستان بايد تلاش كنند كه نيازمندي‌هاي مربوط به برشهاي بافت را با مشخصه‌ها و قابليت‌هاي ميكروتوم تطبيق دهند. اين نيازمندي‌ها شامل موارد زير مي‌شوند:

تعداد متوسط نمونه‌هاي بافت جاسازي شده و sectionها در هر شيفت كاري

پرسنل آزمايشگاه

زمان موردنياز براي آماده سازي بافت و برش دادن آن.

انواع مواد مورد استفاده در آزمايشگاه

انواع روش‌هاي ميكروسكوپي مورد استفاده

گرچه ميكروتوم‌هاي دارای با موتور و كنترل شده با ميكروپرسسور، ممكن است چندين برابر بيشتر از ميكروتوم‌هاي دستي هزينه داشته باشند؛ ولي عملكرد برش اتوماتيك آن ها، باعث صرفه جوئي قابل توجهي در زمان اپراتور و سهولت كار آزمايشگاه‌هايي كه حجم كاري زياد و تعداد پرسنل كم دارند، مي‌شوند. دستگاه‌هايي كـه با كامپيوتر كار مي‌كنند، ويژگي هائي مانند نرخ برش متغير، ضخامت برش و اسـلايـس‌هـاي نـمـونـه قـابـل انـتـخـاب و مـانـيـتـوريـنـگ شـمـارش برش دارنـد. اغـلـب دستگاه‌ها، آلارم هائي دارند كه با خارج شدن از بازه انتخاب شده براي برش، فعال مـــي‌شـــونـــد. در بـــرخــي از مـيـكــروتــوم هــا، زمــانــي كــه ايــن تـغـيـيــرات رخ مــي‌دهـنــد، ميكروپرسسورها به صورت اتوماتيك حركت به سمت جلو يا حركت برش چاقو را تصحيح مي‌كنند. كنترل محور نمونه با ميكروپروسسور باعث مي‌شود كه در طول حركت به سمت جلو، جابجائي يكنواخت تري داشته باشد و لذا دقت برش ميكروتوم افزايش مي‌يابد. اين ويژگي‌ها باعث مي‌شود برش بافت در زمان مورد انتظار آماده شود و نيز برش‌هاي نمونه با ضخامت مطلوب و يكنواخت به دست آيد.

مـيـكـــروتـــوم‌هـــاي بـــا طـيـــف گـسـتـــرده اي از ضـخـامـت‌هـاي بـرش مـي‌تـوانـند كار دو يا چند مـيـكروتوم با بازه‌هاي برش محدودتر را انجام دهند. در آزمايشگاه‌هايي كه هم ميكروسكوپي نــوري و هـم مـيـكـروسـكـوپـي الـكـتـرونـي انـجـام مي‌شود، بازه وسيعي از ضخامت‌هاي برش مورد نياز است. به علاوه در آزمايشگاهي كه هر دو نوع ماده جاسازي پارافين و پلاستيك استفاده مــي‌شــود، مـيـكــروتــوم‌هــايـي كـه مـي‌تـواننـد هـم بلوك‌هاي پارافين و هم بلوك‌هاي پلاستيك را برش دهند، نسبت به ميكروتوم‌هايي كه فقط يك نوع اين بلوك‌ها را مي‌توانند برش دهند، ترجيح دارند.

آزمايشگاه‌ها همچنين بايد فاكتورهاي ديگر مــانـنــد قـطـعـات قـابـل تـعـويـض و لـوزام جـانـبـي اسـتـانـدارد را هـم بـررسـي كننـد. بـه عنـوان مثـال برخي از لوزام جانبي‌هاي ميكروتوم (به عنوان مثال دستگاه )antiroll همراه با برخي دستگاه‌ها به صورت آيتم‌هاي استاندارد ارائه مي‌شوند، اما در مـورد بـرخـي از مدل‌ها به عنوان جزء اختياري هستند كه براي دريافت آن‌ها همراه دستگاه بايد هزينه اضافه اي را پرداخت كرد.

در هنگام ارزيابي هزينه‌هاي عملكرد طولاني مــدت يــك مـيـكــروتــوم خــريــداران بــايــد انــواع تیغ هایی را كه اين دستگاه مي‌تواند استفاده كند در نـظـر بـگـيـرنـد. فـاكـتـورهـاي زيـر بايد ارزيابي شوند:

كاربرد دستگاه: خريداران بايد نوع بافت، مـــاده جــاســازي و اســلايــس نـمــونــه غــالــب در آزمـايـشـگاه و نيز انواع تيغ هایي كه به بـهـترين نحو مي‌توانند اين اسلايس‌ها را توليد كنند بررسي كنند.

اولويت اپراتور: بسياري از اپراتورها بسته به نوع نمونه بافت و ماده جاسازي و نيز نوع آناليز هيستولوژيك كه قرار است انجام شود، استفاده از نـوع خـاصـي از تـيـغ (بـه عنوان مثال يك بار مصرف، استاندارد) را نسبت به انواع ديگر ترجيح مي‌دهند.

انعطاف دستگاه: در مورد برخي از دستگاه‌ها مي‌توان به جاي تيغ‌ هاي استاندارد تیغ مـيـكــروتــوم از تـيـغ هـاي يـك بـارمصـرف استفـاده كـرد؛ بـه عـلاوه بـرخـي از ميكروتوم‌ها مي‌توانند از چندين نوع تیغ متفاوت استفاده كنند در حالي كه در برخي از دستگاه‌ها تنها مي‌توان از يك يا دو نو ع تیغ استفاده كرد. برخي از توليدكنندگان يك سري كيت‌هاي ساخت تیغ هاي شيشه اي به صورت انتخابي ارائه مي‌دهند كه به استفاده كنندگان امكان طراحي سفارشي تیغ هاي شيشه اي براي نيازهاي خاصشان را مي‌دهد. تیغ هاي شيشه اي را مي‌توان تميز و دوباره استفاده كرد. اما اگر آسيب ببينند نمي توان آن‌ها را دوباره تيز كرد.

تیغهـاي يـكـبـار مـصـرف در مـقـايـسـه با تیغ هاي چندبارمصرف: هزينه‌هاي طـولانـي مـدت بـراي تیغ هـاي يـكـبـارمـصـرف مي‌تواند در مقايسه با هزينه تعويض تیغ هـاي چـندبارمصرف بيشتر باشد. با اين حال ممكن است بتوان براي برخي از دسـتـگـاه‌هـا كـه از تیغهـاي اسـتـانـدارد بـا هـزينه بالا استفاده مي‌كنند (به عنوان مثال اولـتـرامـيـكـروتـوم هـائـي كـه از تیغ هـاي الماس يا cryosapphire استفاده مي‌كنند) از تيغ ‌هاي يكبار مصرف ارزان تر - به عنوان مثال تيغ هاي شيشه اي- كه به اندازه ي انواع استاندارد آن، تيز و باريك هستند استفاده كرد. تیغ هاي چند بار مصرف همچنين بايد يا به صورت دستي توسط پرسنل تعليم ديده يا با استفاده از يك تيزكننده اتوماتيك در آزمايشگاه يا با ارسال چاقو به يك مركز سرويس تيزكننده، تيز شوند. در مدت زماني كه تیغ در حال تيز شدن است ميكروتوم غيرقابل استفاده است. بنابراين در هر مركزي بايد حداقل دو تیغ يك بار مصرف براي چنين مواقعي وجود داشته باشد.

آزمايشگاه‌ها بايد مشخصه‌هاي ايمني ميكروتوم‌ها به ويژه مناسب بودن محافظ تیغ را ارزيابي كنند. محافظ‌هاي تیغ بايد به راحتي و به صورت مناسب دور تیغ فيت شوند و نبايد خيلي راحت دربيايند. همچنين در برخي از ميكروتوم‌ها مي‌توان دسته چرخان را در جاي خود قفل كرد تا از حركت تصادفي بلوك نمونه يا حتي انگشتان اپراتوري كه در حال تنظيم نمونه است به داخل تیغ پيشگيري شود. زمان پرسنل و هزينه‌هاي مربوط به نگهداري و اجزاي يك بار مصرف همگي بايد قبل از خريد يك تيزكننده تیغ مـيـكـروتـوم در نـظـر گرفته شوند. برخي از متصديان آزمايشگاهي، خدمات تيزكردن تیغها را از طريق پست ارائه مي‌دهند كه مي‌تواند يك جايگزين بسيار مفيد به ويژه در مورد آزمايشگاه‌هاي شلوغ كه در آن‌ها زمان تكنولوژيست‌ها بسيار گرانبها است باشد. البته اين كار مستلزم اين است كه در آزمايشگاه، موارد يدكي كافي وجود داشته باشد تا زماني كه تيغ در حال تيز شدن است، ميكروتوم غيرقابل استفاده نشود.

برخي از آزمايشگاه‌هاي هيستولوژي كه از چند نوع تيغ براي بريدن نمونه‌ها براي كاربردهاي مختلف استفاده مي‌كنند، وسيله اي براي تيز كردن تيغ ‌هاي با جنس‌ها و شـكل‌هاي مختلف دارند. تيزكننده همه كاره اي كه نياز به نگهداري چنداني ندارد، مي‌تواند از نظر هزينه نسبت به استفاده از تيغه هاي ميكروتوم يكبار مصرف كه هزينه‌هاي تـعـويـض بـالائـي در دراز مـدت دارنـد، مـقـرون به صرفه تر باشد. با اين كه استفاده از تيزكننده‌هاي اتوماتيك، نقش و درگيري اپراتور در تيزكردن تیغ را بسيار كاهش داده، اما يك نقطـه ضعف استفاده از اين تيزكننده ها، زمانبر بودن فرايند تيزكردن تيغ است كه ممكن است بسته به نوع تيغ چندين ساعت طول بكشد. به علاوه استفاده از يك تيزكننده، مستلزم نگهداري و سـرويـس كـردن منظـم آن بـراي حفظ شرايط كاري خوب آن است.

مراحل توسعه

گــرچــه طــراحــي پــايــه مـيكـروتـوم روتاری تـغييري نكرده است، اما توليدكنندگان، كارائي ميكروتوم و سادگي برش با آن را بهبود داده اند. ياتاقان‌هاي غلتكي مخصوص كار سنگين براي عـمـلـكــرد چــرخ، بــرش را سـاده تـر كـرده انـد و محرك‌هاي موتور براي برش دادن اتوماتيك اسـتـفـــاده مــي‌شــونــد. بــرخــي از مـيـكــروتــوم‌هــا مي‌توانند مجهز به يك ميكروسكوپ و منبع نور شوند به نحوي كه اپراتور بتواند برش را دقيق تر مشاهده كند.

بــا ايــن كــه بــا افــزودن مـيكـروپـروسسـورهـا، استفاده از تيزكننده‌هاي تیغ ساده تر شده است، اما تكنيك‌هاي پايه مورداستفاده براي تيز كردن تغييري نكرده و اين كه پيشرفت قابل توجهي در اين حوزه رخ بدهد هم بعيد است. پيشرفت‌هاي محتمل شامل ايجاد انواع جديد مواد ساينده و اصلاح كردن ساينده‌هاي فعلي است.

تيغ هاي يك بارمصرف ميكروتوم‌ها نياز به تيزكننده‌هاي تیغ را كاهش داده اند. با اين حال نياز به دستگاه‌هايي كه تیغ هاي غيراستاندارد را تيز كنند همچنان وجود خواهد داشت.